Глава 9. Исследование физико-химических свойств термостатной и порошкообразной форм плазмы крови, полученных по технологии Plasmolifting

Авторы: Л.Г. Дорожкина, Е.Г. Дорожкина, Ю.И. Великородная

В исследовании представлены данные о физико-химических свойствах плазмы крови, полученной в результате центрифугирования и последующего нагревания при температуре 55, 75 и 95 °С, а также характеристика порошкообразной формы плазмы, полученной в результате дегидратирования.

9.1. Цель исследования

Изучение физико-химических свойств термостатной и порошкообразной форм плазмы крови.

9.2. Материалы и методы

Определение общих белков

Определение количества общего белка в плазме крови выполнили биуретовым методом с помощью набора ВИТАЛ. Принцип его заключается в том, что белки реагируют в щелочной среде с сульфатом меди, образуя хелатные соединения фиолетового цвета. Интенсивность окраски пропорциональна числу пептидных связей.

Определение глюкозы

Для количественного определения глюкозы в плазме крови был использован глюкозооксидазный метод (ВИТАЛ). Принцип метода заключается в окислении β-D-глюкозы кислородом воздуха под действием глюкозооксидазы, в результате чего образуется эквимолярное количество перекиси водорода. Последняя под действием пероксидазы окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации глюкозы в пробе.

Определение общих липидов

Определение концентрации липидов проводили сульфованилиновым методом согласно инструкции производителя с помощью набора BIO-LA-TEST. В основе метода лежит реакция ненасыщенных компонентов липидов с серной кислотой. При нагревании образуется карбониевый анион. Фосфорная кислота этерифицирует OH-группу ванилина. Карбониевый анион взаимодействует с активированной карбонильной группой фосфата ванилина, образуя стабильный окрашенный комплекс.

Определение показателей перекисного окисления липидов

Определение диеновых и триеновых конъюгатов, оснований Шиффа

Первичными продуктами перекисного окисления липидов являются гидроперекиси липидов, при образовании которых в молекуле жирной кислоты формируются сопряженные двойные связи — диеновые конъюгаты. Возможно также образование вторичных продуктов перекисного окисления липидов — конъюгированных триенов и конечных продуктов — оснований Шиффа.

Метод основан на установлении содержания диеновых и триеновых конъюгатов по поглощению липидным экстрактом монохроматического светового потока в ультрафиолетовой области спектра в гексан-изопропанольных фракциях [1, 2]. Поскольку в гексане экстрагируются в основном нейтральные липиды, а в изопропаноле — фосфолипиды, то гексановая фракция свидетельствует об активности перекисного окисления липидов в нейтральных липидах, а изопропанольная — в фосфолипидах.

В данной работе использовали стандартный метод определения продуктов перекисного окисления липидов, адаптированный для планшетного фотометра. К 0,2 мл образца плазмы добавляли 0,6 мл изопропилового спирта, встряхивали 5 мин и оставляли на 10 мин. Далее к липидному экстракту добавляли 0,6 мл гексана, встряхивали и оставляли для разделения фаз на 20 мин. После расслоения фаз (верхнюю) гексановую переносили в объеме 0,5 мл в лунку планшета с плоским дном (48-луночный планшет). К нижнему слою добавляли 150–200 мг прокаленного хлорида натрия для обезвоживания изопропанольного экстракта, центрифугировали 5 мин при 10 000 об./мин и затем также в количестве 0,5 мл переносили в лунку. Замер оптических плотностей (Е) производили с помощью планшетного фотометра SYNERGY HTX (BioTek). Каждая фаза оценивалась против соответствующего контроля при длинах волн 220 нм (поглощение изолированных двойных связей), 232 нм (поглощение диеновых конъюгатов), 278 нм (поглощение конъюгированных триенов) и 400 нм (поглощение оснований Шиффа). Содержание продуктов перекисного окисления липидов оценивали по относительным величинам Е232/Е220, Е278/Е220 и Е400/Е220 и выражали в относительных единицах на 1 мл образца плазмы. Измерение диеновых, триеновых конъюгатов и оснований Шиффа проводились в троекратных повторах с последующим расчетом средней величины.

Определение малонового диальдегида

Малоновый диальдегид является низкомолекулярным соединением с Mr=72,07. Малоновый диальдегид образуется лишь при окислении жирных кислот, имеющих три двойных связи и более. Кроме того, в живых системах малоновый диальдегид взаимодействует с макромолекулами, содержащими первичные аминогруппы, например белками, фосфолипидами и нуклеиновыми кислотами. В результате этой реакции образуются поперечные сшивки между макромолекулами, что уменьшает их конформационную подвижность, делает их токсичными.

Определение малонового диальдегида в плазме производили по методу, описанному В.Е. Каганом и соавт. [3]. Принцип метода заключается во взаимодействии малонового диальдегида при высокой температуре в кислой среде с 2-тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного триметилового комплекса, имеющего максимум поглощения при 532 нм. Определение оптической плотности окрашенного комплекса проводили с помощью планшетного фотометра SYNERGY HTX (BioTek). Измерения проводились в троекратных повторах с расчетом средней величины.

Микроскопия

Флуоресцентные препараты изучали и фотографировали с помощью микроскопа AxioScopeA1 (Zeiss), оборудованного камерой высокого разрешения AxioCamMRc5 и системой дифференциально-интерференционного контраста. Полученные фотографии обрабатывали с помощью программы ZENpro 2012 (Zeiss).

Метод дифференциально-интерференционного контраста (метод Номарского, ДИК-метод) широко применяется для создания контраста в неокрашенных прозрачных образцах и используется как в материаловедении, так и при проведении биологических исследований.

ДИК-метод позволяет определить оптическую плотность исследуемого объекта на основе принципа интерференции и таким образом увидеть недоступные глазу детали. Относительно сложная оптическая система позволяет создать черно-белую картину образца на сером фоне.

Принцип данного метода состоит в том, что поляризованный луч расщепляется призмой Номарского на два луча, которые проходят через образец разными оптическими путями. Длина этих оптических путей (то есть произведение показателя преломления и геометрической длины пути) различна. Впоследствии эти лучи интерферируют при слиянии. Это позволяет создать объемное рельефное изображение, соответствующее изменению оптической плотности образца, акцентируя линии и границы.

9.3. Результаты исследования

Физические характеристики образцов плазмы крови, выдержанных при различных температурных режимах, а также регидратированного порошка плазмы представлены в табл. 9.1.

Физико-химические характеристики плазмы крови, термостатируемой при 55 °С

Макропрепарат представлял собой прозрачную жидкость желтого цвета с pH 7,05 (рис. 9.1).

Микроскопическое исследование образцов показало наличие небольшого количества неизмененных клеточных элементов как в плазме крови, не подвергавшейся нагреванию, так и при нагревании до 55 °С (рис. 9.2–9.4).

Физико-химические характеристики плазмы крови, термостатируемой при 75 °С

Макропрепарат плазмы крови, термостатируемой при 75 °С, представлял собой мутный гель темно-желтого цвета с pH 7,08 (рис. 9.5). Нагревание плазмы увеличивало ее вязкость, вероятно, вследствие частичной коагуляции белка и перехода глобулярных белков в фибриллярные с последующим их набуханием. Так, динамическая вязкость образца плазмы, выдержанного при 75 °С, примерно соответствовала 50% раствору глицерина.

Выдерживание плазмы при 75 °С приводило к частичной коагуляции белков и разрушению клеточных элементов (рис. 9.6, 9.7).

Крайне интересным представлялся тот факт, что температурная обработка плазмы сопровождалась увеличением концентрации белка (табл. 9.2). Вероятнее всего, это связано с разрушением клеточных элементов, присутствующих в плазме, а также частичным гидролизом сложных белковых молекул в щелочной среде при постановке биуретовой реакции, в результате чего в плазме возрастало содержание простых пептидов. Косвенным образом на это указывало и увеличение содержания глюкозы в образцах плазмы (рис. 9.8), нагретой до 55 и 75 °С, на 10 и 40% соответственно.

Физико-химические характеристики плазмы крови, термостатируемой при 95 °С

Образец плазмы крови, выдержанный при 95 °С, который представлял собой гомогенную плотную массу светло-желтого цвета, — результат денатурации белков (рис. 9.9).

Микроскопическое исследование образца показало полное отсутствие клеточного состава (рис. 9.10).

Определение продуктов перекисного окисления липидов продемонстрировало, что нагревание плазмы крови способствовало образованию преимущественно триеновых конъюгатов, то есть соединений с тремя сопряженными двойными связями (табл. 9.3). При этом содержание триеновых конъюгатов возрастало как в гептановой фракции, содержащей в основном нейтральные липиды, так и в изопропанольной фракции, содержащей фосфолипиды.

Физико-химические характеристики плазмопорошка

Порошок плазмы крови, получаемый путем регидратации, представляет собой светло-желтую взвесь порошковой формы (рис. 9.11).

Микроскопирование образца проводилось после его регидратирования (рис. 9.12). Физико-химические характеристики регидратированного образца плазмопорошка соответствовали таковым у нативной формы плазмы крови. Липиды в образце плазмы, подвергшейся вторичной регидратации, больше всего подвержены окислению, что, вероятно, связано с технологическими особенностями получения порошка из нативной плазмы.

Список литературы

1. Гаврилов В.Б., Гаврилова А.Р., Хмара Н.Ф. Изменение диеновых конъюгатов в плазме по ультрафиолетовому поглощению гептановых и изопропильных экстрактов // Лаб. Дело. 1988, № 2. С. 60–64.

2. Хышиктуев Б.С., Хышиктуева Н.А., Иванов В.Н. Методы определения продуктов перекисного окисления липидов в конденсате выдыхаемого воздуха и их клиническое значение // Клиническая лабораторная диагностика. 1996. № 3. С. 13–15.

3. Каган В.Е., Орлов С. Н., Прилипко Л.Л. Проблемы анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов. М., 1986. 238 с.